INMUNOHISTOQUIMICA

La inmunocitoquímica es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G, producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos B. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una molécula que reconoce como extraña, es decir, nuestra molécula problema. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican los anticuerpos producidos, los cuales se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica. Las moléculas complejas como la proteínas tienen en su estructura varios determinantes antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antigénico activará un clon, grupo de de linfocitos B, que producirá anticuerpos contra él. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molécula inyectada irán a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando anticuerpos policlonales. Existe una técnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un tipo de inmunoglobulina G que reconocerá sólo a uno de los determinantes antigénicos de la molécula inyectada. A estos anticuerpos se les denominamonoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).

Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fracción cristalizable y la variable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante antigénico de nuestra molécula. Hay dos sitios de unión por lo que cada inmunoglubulina podría reconocer a dos moléculas o determinantes antigénicos, que han de ser iguales y estar muy próximos entre sí. La fracción cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuos de una misma especie.

Para que un anticuerpo se una a su determinante antigénico localizado en una molécula, ésta no debe alterarse. De otro modo ese determinante antigénico no será reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijación del tejido debe elegirse para preservar al máximo a la molécula que queremos detectar. Por ello se usan diferentes fijadores según el tipo de molécula en la que estemos interados. También es necesario considerar el método de obtención de los cortes. Inclusiones en parafina pueden dañar las moléculas por lo que en la mayoría de los casos se suele trabajar con cortes de vibratomo o con secciones obtenidas por congelación.

Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molécula que queramos detectar, no son visibles con el microscopio por lo que la tendremos que conjugar (unirla) a otras moléculas que nos den una señal visible. Estas moléculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos tipos:moléculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados sustratos solubles en productos insolubles y coloreados. La señal aparece allí donde está la sustancia fluorescente o el enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.

El método del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que veremos más adelante, pero tiene la desventaje de que no son marcajes permanentes puesto que la luz emitida por la molécula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden deshidratarse, montarse y mantenerse permanentemente para su obeservación. Las enzimas habituales que se unen a las inmunoglobulinas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos específicamente a una molécula del tejido.

La conjugación directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se denomina método de detección directa. Hoy en día se suele emplear el método de detección indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la molécula marcadora. Inicialmente se usó el método indirecto denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior), pero actualmente es más frecuente usar el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El método indirecto permite una mayor versatilidad de la técnica y mayor intensidad de señal frente a una misma cantidad de antígeno.

La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos. Son moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molécula tisular, su verdadero potencial se muestra cuando necesitamos una múltiple inmunodetección, es decir, dos o más moléculas presentes en una misma célula o matriz extracelular de forma simultánea. Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de longitudes onda con el que iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar moléculas diferentes. Tomando fotografías tras cada excitación y superponiendo dichas imágenes podemos averiguar si las moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma célula.

Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoquímica usando un anticuerpo primario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

Inmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ótico.

Detección con inmunofluorescencia de dos antígenos en una sección de tejido nervioso: la molécula tirosina hidroxilasa (a la izquierda) y el neuropéptido Y (a la derecha), usando fluoresceína y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un método de marcaje indirecto. En esta sección la tirosina hidroxilasa aparece en cuerpos celulares (flecha) mientras que el neuropéptido Y aparece en fibras. El asterisco indica donde está la célula con tirosina hidroxilasa, pero no emite luz visible porque la foto se ha tomado iluminando la sección con una longitud de onda que no excita a la fluoresceína.

Detección simultánea de dos moléculas situadas en el mismo tejido mediante inmunofluorescencia. La razón de que los dos anticuerpos primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratón y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.INMUNOHISTOQUIMICA