Técnica de Hematoxilina y Eosina
La técnica de H y E , también llamada técnica convencional, utiliza como fundamento la afinidad de las moléculas ácidas y básicas para atraer a su opuesto. Así, una molécula ácida tendrá afinidad por una molécula básica, y viceversa. Una simple reacción química. En esta técnica el colorante básico es la hematoxilina, mientras que el ácido es la eosina.
La hematoxilina, que es de color azulado violáceo, tenderá a unirse a moléculas ácidas (por ser de naturaleza básica).
¿Qué moléculas son ácidas en una célula?
Ø Núcleo celular: por ser rico en ACIDO Desoxirribonucleico (ADN)
Ø Ribosomas y polirribosomas: ricos en ACIDO Ribonucleico (ARN)
Ø Retículo Endoplasmático Rugoso (REG): rico en RIBOSOMAS.
CONCLUSIÓN: Toda molécula ácida, se unirá al colorante básico hematoxilina. En este caso, la molécula se define como basófila (baso = básico, filia = afinidad)
| Acino seroso |
La eosina, que es de color rojo pálido o rosado, tenderá a unirse a moléculas básicas (por ser de naturaleza ácida).
¿Qué moléculas son básicas en una célula?
Ø Mitocondrias: por estar cargadas de enzimas (proteínas)
Ø Proteínas intracelulares: como la actina y la miosina del tejido muscular
Ø Proteínas extracelulares: como el colágeno del tejido conectivo.
| Músculo estriado esquelético | |
| Tejido conectivo denso irregular |
CONCLUSIÓN: Toda molécula básica, se unirá al colorante ácido eosina. En este caso, la molécula se define como acidófila (o eosinófila, por su afinidad al colorante eosina).
...Entonces, cuando una parte del preparado teñido con la técnica de H y E no se tiñe, ¿debo inferir que ahí se encuentra una molécula neutra?
NO.
Muchas veces ocurre que vemos una célula cuyo citoplasma no se ha teñido. No necesariamente significa que haya estructuras neutras. Puede darse el caso, como lo representan los lípidos, que no soportan el pasaje de alcoholes de la técnica de H y E. De esta manera, al perderse el contenido, no hay nada que teñir.
Los lípidos tienen una técnica específica que preserva su contenido, llamada Técnica de Sudán.
Técnica de SUDAN
¿Qué estructuras son sudanófilas?
Todas aquellas ricas en lípidos
Ø Tejido adiposo blanco: presenta una gran vacuola lipídica que ocupa todo su citoplasma.
Ø Vainas de mielina de las neuronas
Ø Vesículas de almacenamiento de colesterol de las células productoras de hormonas esteroideas: como el espongiocito de la corteza suprarrenal.
Ø Retículo endoplasmático Liso (REL).
¿Toda célula que presente una imagen negativa tiene en su interior lípidos que se lavaron en la técnica?
NO.
Las estructuras con alto contenido en glúcidos, como el glucógeno, proteoglicanos y mucopolisacáridos, también pueden dar una imagen negativa (no se tiñen) con la técnica convencional.
Las estructuras glucídicas presentan una técnica selectiva para su tinción, llamada técnica de PAS (Peryodic Acid - Schiff).
Técnica de PAS
¿Qué estructuras dan positivas a la reacción de PAS?
Todas aquellas ricas en glúcidos
Ø Vacuolas de células caliciformes
Ø Vesículas de almacenamiento de glándulas mucosas (como los acinos mucosos o mixtos)
Ø Vesículas de almacenamiento de glucógeno: como en el hepatocito o las células musculares
Ø Glucocálix
Ø Membrana basal
| PAS 1 | |
| PAS 2 |
Conceptos finales
Se torna imprescindible comprender las distintas afinidades tintoriales que tienen las estructuras intracelulares, para comprender la visión al microscopio, y poder sacar conclusiones veraces.
A su vez, el núcleo de una célula SIEMPRE es basófilo. Podrá ser intenso (si la cromatina está condensada) o leve (si la cromatina esta laxa). Pero siempre está en la gama de lo basófilo.
Es el citoplasma de una célula el que tiene variaciones en la coloración. Esto depende fundamentalmente de las organelas que se encuentren en su interior.
Una célula que sintetice proteínas de exportación, tendrá en su citoplasma grandes cantidades de REG. Esto no significa que UNICAMENTE tenga REG. También tiene mitocondrias.
Entonces, ¿cómo definir la coloración del citoplasma?
La coloración final de un citoplasma depende SIEMPRE de la organela que predomine en su interior.
Así, una célula que sintetice proteínas, tendrá mayor cantidad de REG que de mitocondrias, y por ende se teñirá su citoplasma basófilo.
Lo mismo ocurre con una célula encargada de la contracción (tejido muscular). Si bien tiene polirribosomas para la síntesis de proteínas endógenas (las proteínas contráctiles), son estas últimas las que predominan en su interior, y por ende muestran un citoplasma acidófilo.
Una excepción interesante lo constituye el fibroblasto del tejido conectivo. Dicha célula está encargada de la síntesis de proteínas (como lo es el colágeno). Por ende, presenta abundantes cantidades de REG en su interior. Las micrografías electrónicas demuestran que efectivamente es así. Sin embargo, al teñirlas con H y E, su citoplasma se ve acidófilo. Esta aparente paradoja histológica se explica fácilmente cuando uno conoce la información teórica de la célula. Si bien tiene abundante REG, en su interior almacena a los precursores de la proteína colágena en vesículas de almacenamiento. Dichas vesículas enmascaran al REG, dándole al citoplasma una sutil acidofilia.
Metacromasia
La metacromasia es una propiedad que presentan ciertos colorantes de variar el espectro de emisión de luz, dependiendo de su estado monomérico o polimérico. Y es aquí donde debemos resaltar el hecho que es una propiedad del colorante, y no del tejido en cuestión.
Este cambio en su coloración se ve cuando se fija a ciertas moléculas cargadas de abundantes cargas negativas llamadas polianiones (las cuales pasan a definirse cromótropas).
Entonces, ¿la propiedad del cambio es por el colorante, o por la existencia de polianiones?
La respuesta es muy simple. Si a un polianión lo tiño con la técnica convencional de H y E, por sus propiedades químicas tenderá a unirse a la hematoxilina (es basófilo). Es decir que no depende del tejido, sino del colorante específico utilizado.
| Mastocito metacromatico |
Un ejemplo de colorante metacromático lo es el azul de toluidina. Su color monomérico (aquel que se encuentra en el frasco previo a la tinción) es de color azul. Sin embargo, en presencia de moléculas polianiónicas vira su espectro a la gama del rojo. De hecho, puede presentar distintos colores (en la gama del azul y rojo) de acuerdo con el estado de agregación de las moléculas.
| Metacromasia bajo aumento | |
| Metacromasia alto aumento |
Comprender este fenómeno visual requiere de una exacta comprensión de dos definiciones
¿Qué es un monómero y qué es un polímero?
Un monómero es la mínima unidad funcional, Compuesto químico constituido por moléculas simples. Un polímero (compuesto de varias partes), es un compuesto químico, natural o sintético, formado por polimerización y que consiste esencialmente en unidades estructurales repetidas (Diccionario de la Real Academia Española, 1992).
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